Un súpervillano roba el PX-41, un suero mutante. El director de la Liga Antivillanos (LAV), Silas Maculo, decide contratar a Gru para que investigue y descubra quien es el ladrón del suero. La LAV ha acudido a Gru porque como ex villano sabe cómo piensa y actúa un villano, por lo que puede serle útil. Gru se niega a ayudar, ya que actualmente tiene una vida tranquila cuidando a las niñas y se dedica a fabricar mermelada. Sin embargo, Gru accede después de que el doctor Nefario (que echa de menos ser malo) decida dejar de trabajar para él, ya que otro villano le ha hecho una oferta de trabajo. Gru y la agente Lucy Wilde investigan en el Centro Comercial Paraíso, donde se les da una pastelería llamada "Endúlzame el Día" como su cuartel general. Gru sospecha que Eduardo Pe´rez, el dueño de un restaurante mejicano llamado "Salsa y Salsa" es en realidad un súpervillano conocido como El Macho. Gru le explica a Lucy que hace tiempo El Macho se lanzó hacia la boca de un volcán a lomos de un tiburón y con dinamita pegada al cuerpo, supuestamente murió.
Gru y Lucy investigan ‘Salsa y Salsa’ por la noche, pero no encuentran ninguna prueba de que Eduardo sea el ladrón del PX-41. Las niñas conocen a Lucy y Agnes (quien desea tener una madre) en seguida desea que Lucy se case con Gru y se convierta en su madre. Gru les asegura a las niñas que su relación con Lucy es estrictamente profesional.

Al día siguiente, Maculo y los agentes de la LAV detienen a Floyd, ya que previamente encontraron un frasco con restos de PX-41 en su tienda, aunque Floyd asegura que le tendieron una trampa. La investigación está cerrada y Lucy va a ser enviada a la sede de la LAV en Australia. Justo antes de marcharse, Lucy le regala a Gru su carmín eléctrico. A Gru se le parte el corazón, ya que está enamorado de ella, pero no se atreve a llamarla para pedirle una cita. En un intento de olvidarse de Lucy, Gru lleva a las niñas a una fiesta mejicana en casa de Eduardo y finalmente descubre que sus sospechas eran ciertas: Eduardo es El Macho. Gru descubre que El Macho y Nefario (el nuevo ayudante de El Macho) han secuestrado a casi todos los minions de Gru y les han inyectado el PX-41, convirtiéndolos en monstruos púrpuras indestructibles. El Macho planea mandar cohetes llenos de minions malvados a las principales ciudades y conquistar el mundo. El Macho invita a Gru a unirse a él y a Nefario. Gru se escaquea y se reúne con las niñas, solo para ver que Antonio se ha ido con otra chica y ha dejado plantada a Margo. En venganza, Gru usa su rayo congelador para congelar a Antonio justo antes de huir de la fiesta con las niñas.
Mientras, Lucy se dirige a Australia en un avión, pero se da cuenta de que siente algo por Gru, así que salta del avión en ala delta y regresa. Lucy aterriza en la fiesta mejicana. Pollito, el pollo mascota de El Macho, le roba a Lucy sus credenciales de la LAV; de esa manera, El Macho descubre que Lucy trabaja para la LAV. Lucy es capturada por El Macho, pero Nefario decide avisar a Gru, quien junto con dos minions buenos se dispone a rescatar a Lucy. En casa de Gru, un minion malvado ataca a las niñas, pero Nefario aparece y le inyecta al minion el suero del PX-41, devolviéndolo a la normalidad. Nefario y las niñas mezclan el antídoto con la mermelada y se disponen a ayudar a Gru. Los dos minions buenos se disfrazan de minions malvados y Gru se hace pasar por su prisionero. Con esos disfraces, los tres entran en la fortaleza de El Macho, pero son descubiertos y acorralados por los minions malvados. Afortunadamente, Nefario y las niñas llegan en la nave y recogen a Gru. Gru y los demás les disparan mermelada a los minions malvados y los devuelven a la normalidad. El Macho se bebe un frasco de PX-41 y ataca a Gru, pero Gru lo derrota con el carmín eléctrico de Lucy. Nefario remata a El Macho con una Pistola Pedo.

Ciento cuarenta y siete citas más tarde, Gru y Lucy se casan y las niñas tienen por fin una madre. La película termina con los minions cantando sus versiones de ‘I Swear’ y ‘YMCA’ y la familia bailando.
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